Главная » Статьи » Молекулярно-генетическая диагностика в онкологии NGS FISH-тест ПЦР секвенирование по Сэнгеру и пр.

Молекулярно-генетическая диагностика в онкологии NGS FISH-тест ПЦР секвенирование по Сэнгеру и пр.

Различные методы молекулярно-генетической диагностики в онкологии предоставляют врачу (химиотерапевту, клиническому онкологу) сведения о наличии, расположении и типе мутаций в генах конкретного пациента. Информация о мутациях (и их сочетаниях) помогает выбрать наиболее эффективный вариант лечения уже диагностированного онкозаболевания, либо указать на чрезвычайно высокую вероятность рака, передающегося по наследству (так называемые наследственные или семейные раки).

Секвенатор Illuminaдля выполнения секвенирования генома нового поколения (NGS), установленный в молекулярно-генетической лаборатории МИБС

Основные практические задачи, которые решает молекулярно-генетическое тестирование в онкологии

  • поиск “поломок” в генах клеток опухолис целью выявления наиболее эффективнойтактики лечения — например, для определения мутаций, при которых эффективной будет иммунотерапия или таргетная терапия;
  • раннее профилактическое выявление генных мутаций, ответственных за развитие наследственных раков у здоровых пациентов, в чьей семейной истории есть случаи онкологических заболеваний из списка наиболее часто передающихся по наследству — наследственный ДНК-онкотест (на базе NGS).

Список генов, подлежащих рассмотрению, задается задачами исследования. Это позволяет оптимизировать стоимость и срок выполнения молекулярно-генетической диагностики, выбрав оптимальный метод либо комбинацию методов исследования генов ДНК конкретного человека. В онкологии изучению подлежат гены, мутации в которых участвуют в развитии рака.

Наиболее часто с развитием опухолей связаны мутации в таких генах как: BRAF, BRCA, EGFR, HRAS, KRAS, MET и др.

Научно доказано, что клиническую важность имеют не только мутации в отдельных генах, но и сочетание различных мутаций в разных участках генов. По этой причине наиболее эффективно применение методов, которые позволяют выявить мутации в любом из генов, ассоциированных с развитием онкологического заболевания, без предварительного указания зоны поиска (изучается так называемая “панель генов”).

Преимущество в точности интерпретаций получают лаборатории, проводящие поиск сочетаний выявленных мутаций в специализированных постоянно пополняемых базах данных международного уровня.

Секвенирование нового поколения (NGS)

Наиболее информативным методом молекулярно-генетической диагностики в клинической онкологии является секвенирование нового поколения (NGS). Эта методика предусматривает секвенирование (разделение) молекулы ДНК конкретного человека на отдельные гены с последующим рассмотрением и фиксацией найденных отклонений от нормального строения каждого гена из интересующего списка (панели генов).

Панель генов, поиск мутаций в которых методом NGS можно заказать в молекулярно-генетической лаборатории МИБС: ATM, ATR, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CDK12, CHEK1, CHEK2, EPCAM, FANCL, MLH1, MSH2, NBN, NF1, PALB2, PMS2, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD54L, STK11, TP53, POLE

Основным отличием секвенирования нового поколения, основанного на применении высокотехнологичного оборудования (секвенаторов) и мощных вычислительных систем (биоинформатика), является широкий спектр одномоментно изучаемых генов и высокая точность в сочетании с умеренной стоимостью.

Какой лучше: достоинства и недостатки разных методов молекулярной диагностики

Среди современных видов молекулярной генетической диагностики в онкологии наибольшее применение имеют ПЦР (полимеразно-цепная реакция) и секвенирование нового поколения (NGS, next generation sequencing), которые практически вытеснили из клинической практики ранее имевшее широкое применение секвенирование по Сэнгеру.

Остальные методы либо уступают по информативности и точности получаемых данных, либо используются исключительно в научной деятельности из-за высокой стоимости тестирования.

Отдельно следует упомянуть цитогенетический метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ). Так называемый FISH-тест выполняется для подтверждения предположений клинического онколога о наличии специфических мутаций в определенных генах и служит для избрания оптимальной тактики лечения. Однако более корректно отнести FISH к разделу морфологических исследований, так как основой метода является микроскопическая визуализация процесса взаимодействия компонентов во время исследования. В таком случае любые заключения являются субъективными и зависят от квалификации специалистов, выполняющих диагностику. Кроме того, некорректно сравнивать FISH-тест с другими видами генетической диагностики — часто FISH имеет специфическое применение в качестве единственного возможного метода диагностики, например, при таких заболеваниях, как миелолейкоз, лейкоз, хронический лимфолейкоз и др.

NGS (секвенирование нового поколения)

Позволяет рассмотреть все мутации в заданном списке генов в рамках одного исследования (исследование панели генов), давая полную картину имеющихся мутаций, что позволяет избежать дополнительного тестирования. Важное значение данного метода генетической диагностики для медицины нашло отражение в самом его названии — “новое поколение” характеризует превосходство в объеме и точности предоставляемой информации.

Обработка огромного количества информации о ДНК конкретного человека, получаемого при NGS, позволяет:

  • определить и описать (указать расположения в конкретном гене) отклонения от нормального для популяции строения ДНК;
  • сравнить имеющиеся сочетания различных мутаций с базами данных для определения фактора онкогенности (способности вызывать онкологическое заболевание) выявленных “наборов” мутаций;
  • если выполняется наследственный ДНК-онкотест на базе NGS — не только выявить мутации, ассоциированные с наследственными (семейными) раками, но и указать в заключении на необходимость дополнительной консультации с онкологом для принятия мер по предупреждению и раннему выявления начала заболевания.

Значительный объем данных, получаемых при выполнении секвенирования генома, обуславливает продолжительность выполнения NGS-секвенирования генома. Например, изучение панели наиболее распространенных генов, мутации в которых имеют клиническую значимость в онкологии (примерно 30 генов), методом NGS выполняется в срок 20-30 рабочих дней.

Технологические возможности секвенаторов, работающих в лаборатории МИБС, позволяют говорить о резерве снижения срока выполнения тестирования по мере роста спроса на профессиональную генетическую диагностику со стороны российских онкологов из других регионов. С конца 2021 года МИБС предлагает удобную схему логистики образцов тканей опухолей и образцов крови для выполнения NGS-исследований, что открывает доступ к высокотехнологичной диагностике онкологу из любого региона, тем самым повышая качество лечения онкологических заболеваний на уровне государства.

Для выбора наиболее оптимальной схемы лечения с включением в ее состав иммунотерапии либо таргетной терапии, клинические онкологи лечебных центров, входящих в структуру МИБС (Онкологическая клиника МИБС, Центр протонной терапии МИБС) используют данные NGS, полученные в собственной молекулярно-генетической лаборатории

ПЦР (полимеразная цепная реакция)

Полимеразная цепная реакция — это хорошо знакомый, точный и востребованный метод определения мутаций в указанных генах. Именно ПЦР, точнее, информация о мутациях в наиболее распространенных генах (чаще всего BRAF-мутации, а также BRCA1/BRCA2, EGFR, HRAS, KRAS, MET) стал основой развития технологий таргетной терапии и иммунотерапии.

С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. В таком случае невысокая стоимость и небольшой срок выполнения исследования, являющиеся преимуществом ПЦР при решении точечных диагностических задач при необходимости всестороннего изучения генов у онкологических пациентов не перекрывают определенных ограничений, которые присущи ПЦР.

В первую очередь, это недостаточная информативность — один ПЦР-анализ позволяет проверить мутацию в одном конкретном гене, которую может предположить врач-онколог. В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований.

Сравнение полноты исследования генетических мутаций между ПЦР и секвенированием нового поколения (NGS)

Рассмотрим «разрешающую способность» этих двух методов на примере тестирования образца опухоли у пациентки с необходимостью выявления возможных мутаций BRCA1/BRCA2. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами:

ПЦР исследование — позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов (к.м.н. Гордиев М.Г., из личного архива)

Cеквенирование нового поколения (NGS) — диагностируются все мутации в генах BRCA1/BRCA2, а также все мутации в других генах (к.м.н. Гордиев М.Г., из личного архива)

При этом даже многократное ПЦР-тестирование опухоли, в отличие от метода секвенирования нового поколения (NGS), не дает исчерпывающей информации о мутациях в генах, не вошедших в список для изучения. Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога.

Секвенирование по Сэнгеру

С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера — низкая чувствительность. Это означает, что для выявления генной мутации обязательным условием является наличие в предоставленных образцах опухолевых тканей не менее 15-20% клеток с мутациями. Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов (как следствие — пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным).

Учитывая развитие и доступность в России (в том числе по ОМС в МИБС) более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии.

При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика?

Список основных видов рака, при лечении которых информация о генных мутациях имеет практическую клиническую ценность:

  • немелкоклеточный рак легкого — гены EGFR, BRAF, KRAS, MET, NRAS, ERBB2, JAK2, JAK3
  • рак толстой кишки (колорректальный рак) — гены KRAS, NRAS, BRAF
  • меланома — гены BRAF, NRAS, KIT
  • гастроинтестинальная стромальная опухоль — гены PDGFRA, KIT
  • глиальные опухоли, острый миелоидный лейкоз — гены IDH1, IDH2
  • рак молочной железы — гены PIK3CA, BRCA1, BRCA2
  • рак яичников — гены BRCA1, BRCA2, TP53
Читайте также:  Диагностика и лечение гипогликемии Александров

Секвенирование нового поколения в МИБС: в чем преимущество?

Наша лаборатория использует NGS-секвенирование на оборудовании Illumina, являющееся на начало 2022 года “золотым стандартом” в отрасли секвенирования генома. Данное оборудование, точнее, технологический цикл секвенирования с использованием оборудования Illumina, обеспечивает высокую скорость расшифровки (секвенирования) ДНК и относительно низкую стоимость исследования, позволяющую использовать этот современный диагностический метод в широкой клинической практике. Интерпретация полученных данных проводится в соответствии с постоянно дополняемыми международными информационными базами мутаций.

В нашей лаборатории работают уникальные специалисты, имеющие профессиональную подготовку и богатый подтвержденный опыт как клинической, так и научной работы в направлении секвенирования генома. Вовлеченность в международное профессиональное сообщество и постоянное взаимодействие с клиническими онкологами и химиотерапевтами лечебных центров МИБС позволяет оперативно реагировать на потребности отрасли.

Именно поэтому услуги молекулярно-генетической лаборатории МИБС востребованы онкологами по всей РФ — с конца 2021 года образцы для выполнения исследования можно передать в любом из региональных центров МИБС либо отправить курьерской службой (для получения подробной информации о логистике образцов, обратитесь любым из доступных на сайте способов).

К тому же большинство исследований, связанных с определением эффективности лечения, могут быть выполнены в нашей лаборатории за счет ОМС, независимо от региона проживания гражданина РФ.

Чтобы заказать генетический анализ опухоли методом NGS в МИБС по ОМС, звоните +7 (812) 244-06-31, пишите ngs@ldc.ru или заполните форму обратной связи и наши специалисты свяжутся с Вами в кратчайший срок для уточнения информации

ДНК-тест рисков наследственного рака (на основе NGS)

С появлением метода секвенирования генома нового поколения, позволяющего одномоментно проанализировать широкую панель генов и сравнить с имеющейся всемирной базой выявленные мутации, на новый виток развития выходят программы предупреждения и ранней диагностики широкого ряда онкологических заболеваний — программы скрининга, которые включают исследование наследственных рисков развития онкозаболеваний.

На сегодня научно доказано, что на долю наследственного фактора приходится до 20% всех случаев некоторых видов онкологических заболеваний (например, наследственный рак молочной железы или рак яичников). У пациентов, несущих гены семейных раков, вероятность развития онкологического заболевания составляет до 90% вместо среднего для популяции значения в 10%. В целом 1,5-2% всех людей в популяции имеют генные мутации, которые говорят о повышенном риске рака.

Наиболее частые наследственные (семейные) раки:

  • рак молочной железы (как у женщин, так и у мужчин);
  • рак яичников;
  • рак предстательной железы;
  • колоректальный рак;
  • рак поджелудочной железы;
  • рак желудка;
  • меланома.

Наиболее оптимальным вариантом является ДНК тест наследственного рака у тех, кто входит в группу риска — семейная история одного вида рака в нескольких поколениях, наличие особенностей течения заболевания (например, двусторонний рак молочной железы, рак груди у мужчин, рак яичников или молочной железы в возрасте до 50 лет и др.). В такой группе вероятность развития опухолей значительно выше, чем у просто носителей мутаций.

Чтобы заказать ДНК-тест рисков наследственного рака в МИБС, звоните +7 (812) 244-06-31, пишите ngs@ldc.ru или заполните форму обратной связи и наши специалисты свяжутся с Вами в кратчайший срок для уточнения информации

Фактически, предоставив в лабораторию МИБС образец крови, можно предсказать рак. И, если ДНК-тестирование покажет наличие определенного набора генных мутаций, у пациента в сотрудничестве с врачом-генетиком и врачом-онкологом появляется шанс предпринять необходимые радикальные либо терапевтические действия, чтобы снизить или полностью исключить риск развития данного вида рака.

Самым известным примером такого подхода является актриса Анджелина Джоли, в семейной истории которой было несколько случаев рака молочной железы. Этот фактор в сочетании с выявленными мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 показал максимальную вероятность раннего развития рака. Поэтому актриса выбрала наиболее радикальный путь (двухсторонняя мастэктомия и тотальная овариэктомия). В других случаях возможны и более мягкие решения в пределах персонализированного скрининга: более пристального наблюдения с более частой диспансеризацией, расширение состава скрининга (например, регулярная дерматоскопия у пациентов с семейной меланомой, МРТ молочных желез для молодых пациенток с семейным раком груди, контроль динамики уровня ПСА у пациентов с наследственным раком простаты).

Анализ msi при онкологии что это цена

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

ГБУ РО «Областной клинический онкологический диспансер

ГБУ РО «Областной клинический онкологический диспансер

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

Иммуногистохимическое исследование маркеров MSI при раке молочной железы

Журнал: Архив патологии. 2021;83(1): 12‑17

Кузнецова О.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Виноградов М.И., Шомова М.В., Франк Г.А. Иммуногистохимическое исследование маркеров MSI при раке молочной железы. Архив патологии. 2021;83(1):12‑17.
Kuznetsova OA, Zavalishina LE, Andreeva YuYu, Vinogradov MI, Shomova MV, Frank GA. Immunohistochemical study of MSI markers in breast cancer. Arkhiv Patologii. 2021;83(1):12‑17. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/patol20218301112

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить экспрессию маркеров микросателлитной нестабильности, выявляемую иммуногистохимическим методом и сравнить ее с PD-L1-статусом в люминальном B, HER2-негативном и тройном негативном раке молочной железы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследование включены опухоли 40 пациенток с тройным негативным и люминальным B, HER2-негативным подтипами. Иммуногистохимическое исследование проведено с антителами Ventana: anti-MLH1 (клон M1), anti-MSH2 (клон G219-1129), anti-PMS2 (клон A16-4), и anti-MSH6 (клон SP93). Оценку MSI проводили по стандартным критериям.

РЕЗУЛЬТАТЫ

PD-L1-позитивный статус имели 14 (35%) из 40 пациенток. Более того, наличие MSI-H выявлено лишь в 1 (2,50%) случае. Двухлетняя выживаемость больных составила 87,5%, следует отметить, что медиана выживаемости не была достигнута ни в обследуемой выборке, ни при разделении на группы по статусам PD-L1 и MSI. Рейтинг общей выживаемости у пациенток с наличием MSI составил 75% (3/4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первое сравнительное исследование экспрессии PD-L1 и иммуногистохимических маркеров MSI, проведенное на малой выборке, не позволяет сделать однозначные выводы, но показывает необходимость исследования этого феномена на больших выборках и с использованием генетических методов.

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

  • ORCID: 0000-0002-9721-6355

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

  • ORCID: 0000-0002-0677-7991

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

  • ORCID: 0000-0003-4749-6608

ГБУ РО «Областной клинический онкологический диспансер

  • ORCID: 0000-0002-8173-6823

ГБУ РО «Областной клинический онкологический диспансер

  • ORCID: 0000-0002-6235-0925

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

  • ORCID: 0000-0002-3719-5388

Концепция и дизайн исследования — Г.А. Франк

Сбор и обработка материала — М.И. Виноградов, О.А. Кузнецова

Статистическая обработка — О.А. Кузнецова

Написание текста — Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева

Редактирование — М.В. Шомова, Ю.Ю. Андреева

Дата принятия в печать:

Наличие конфликта интересов :

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  1. Schmid P, Rugo HS, Adams S, Schneeweiss A, Barrios CH, Iwata H, Dieras V, Henschel V, Molinero L, Chui SY, et al. Atezolizumab plus nab-paclitaxel as first-line treatment for unresectable, locally advanced or metastatic triple-negative breast cancer (IMpassion130): updated efficacy results from a randomised, double-blind, placebocontrolled, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2020;21(1):44-59. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(19)30689-8
  2. Raez L, Santos E. Tumor type-agnostic treatment and the future of cancer therapy. Target Oncol. 2018;13(5):541-544. https://doi.org/10.1007/s11523-018-0593-y
  3. Jiricny J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7(5):335-346. https://doi.org/10.1038/nrm1907
  4. Peltomaki P. Role of DNA mismatch repair defects in the pathogenesis of human cancer. J Clin Oncol. 2003;21(6):1174-1179. https://doi.org/10.1200/JCO.2003.04.060
  5. Lamers M, Perrakis A, Enzlin J, Winterwerp H, de Wind N, Sixma T. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G×T mismatch. Nature. 2000;407(6805):711-717. https://doi.org/10.1038/35037523
  6. Salem ME, Puccini A, Grothey A, Raghavan D, Goldberg RM, Xiu J, Korn WM, Weinberg BA, Hwang JJ, Shields AF, et al. Landscape of tumor mutation load, mismatch repair deficiency, and PD-L1 expression in a large patient cohort of gastrointestinal cancers. Mol Cancer Res. 2018;16(5):805-812. https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-17-0735
  7. Viale G, Trapani D, Curigliano G. Mismatch repair deficiency as a predictive biomarker for immunotherapy efficacy. Biomed Res Int. 2017;2017:4719194. https://doi.org/10.1155/2017/4719194
  8. Франк Г.А., Кузнецова О.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Москвина Л.В. Исследование PD-L1-статуса рака молочной железы с использованием моноклонального антитела SP142 и перспективы для определения лечебной тактики. Архив патологии. 2019;81(5):5-10. https://doi.org/10.17116/patol2019810515
  9. Emens LA, Cruz C, Eder JP, Braiteh F, Chung C, Tolaney SM, Kuter I, Nanda R, Cassier PA, Delord JP, Gordon MS, ElGabry E, Chang CW, Sarkar I, Grossman W, O’Hear C, Fassò M, Molinero L, Schmid P.Long-term clinical outcomes and biomarker analyses of atezolizumab therapy for patients with metastatic triple-negative breast cancer: a phase 1 study. JAMA Ooncol. 2019;5(1):74-82. https://doi.org/10.1001/jamaoncol.2018.4224
  10. Fusco N, Lopez G, Corti C, Pesenti C, Colapietro P, Ercoli G, Gaudioso G, Faversani A, Gambini D, Michelotti A, Despini L, Blundo C, Vaira V, Miozzo M, Ferrero S, Bosari S. Mismatch repair protein loss as a prognostic and predictive biomarker in breast cancers regardless of microsatellite instability. JNCI Cancer Spectr. 2018;2(4):pky056. https://doi.org/10.1093/jncics/pky056
  11. Zang YS, Dai C, Xu X, Cai X, Wang G, Wei J, Wu A, Sun W, Jiao S, Xu Q. Comprehensive analysis of potential immunotherapy genomic biomarkers in 1000 Chinese patients with cancer. Cancer Med. 2019;8(10):4699-4708. https://doi.org/10.1002/cam4.2381
  12. Muenst S, Schaerli AR, Gao F, Däster S, Trella E, Droeser RA, Muraro MG, Zajac P, Zanetti R, Gillanders WE, Weber WP, Soysal SD. Expression of programmed death ligand 1 (PD-L1) is associated with poor prognosis in human breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2014;146(1):15-24. https://doi.org/10.1007/s10549-014-2988-5
  13. Li Z, Dong P, Ren M, Song Y, Qian X, Yang Y, Li S, Zhang X, Liu F. PD-L1 expression is associated with tumor FOXP3+ regulatory T-cell infiltration of breast cancer and poor prognosis of patient. J Cancer. 2016;7(7):784. https://doi.org/10.7150/jca.14549
  14. Beckers RK, Selinger CI, Vilain R, Madore J, Wilmott JS, Harvey K, Holliday A, Cooper CL, Robbins E, Gillett D, Kennedy CW, Gluch L, Carmalt H, Mak C, Warrier S, Gee HE, Chan C, McLean A, Walker E, McNeil CM, Beith JM, Swarbrick A, Scolyer RA, O’Toole SA. Programmed death ligand 1 expression in triple-negative breast cancer is associated with tumour-infiltrating lymphocytes and improved outcome. Histopathology. 2016;69(1):25-34. https://doi.org/10.1111/his.12904
  15. AiErken N, Shi HJ, Zhou Y, Shao N, Zhang J, Shi Y, Yuan ZY, Lin Y. High PD-L1 expression is closely associated with tumor-infiltrating lymphocytes and leads to good clinical outcomes in Chinese triple negative breast cancer patients. Int J Biol Sci. 2017;13(9):1172-1179. https://doi.org/10.7150/ijbs.20868
  16. Kim A, Lee SJ, Kim YK, Park WY, Park DY, Kim JY, Lee CH, Gong G, Huh GY, Choi KU. Programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in tumour cell and tumour infiltrating lymphocytes of HER2-positive breast cancer and its prognostic value. Sci Rep. 2017;7(1):11671. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11905-7
Читайте также:  Неоперабельный рак

Сегодня проводятся множественные клинические исследования противоопухолевых препаратов, ингибиторов контрольных точек иммунитета. Мишенью для терапии становятся опухоли различных локализаций, в том числе и рак молочной железы. В рамках исследования IMpassion130 получены обнадеживающие результаты выживаемости пациенток с тройным негативным подтипом рака молочной железы. На фоне проводимой терапии удалось достичь средней выживаемости в 25 мес (95% ДИ 19,6—30,7) у больных с местно-распространенным или метастатическим процессом, что на 7 мес дольше, чем у больных, не получавших атезолизумаб [1].

К сожалению, не всем пациентам показано лечение ингибиторами контрольных точек. На текущий момент для различных локализаций разработано несколько способов определения чувствительности к препарату. Основным считается оценка экспрессии лиганда программируемой клеточной гибели PD-L1. Наряду с этим весьма актуально определение уровня микросателлитной нестабильности при помощи иммуногистохимического метода. В последнее время особый интерес к новым иммуногистохимическим маркерам связан с появлением нового подхода к выбору лекарственной терапии (Tumor Type-Agnostic Treatment) [2]. Этот способ предполагает назначение лекарственного препарата только на основе результатов тестирования без учета локализации процесса.

Микросателлиты — это короткие повторяющиеся последовательности, присутствующие в геноме в большом количестве. Во время синтеза ДНК именно в этих участках часто происходят ошибки, что приводит к формированию гетеродуплесной ДНК. Участки новой созданной цепи ДНК, не соответствующие материнской, не способны формировать водородные связи, так как основания нуклеотидов в этих участках не комплиментарны. Такие фрагменты нити приобретают форму «петли» и требуют корректировки со стороны системы репарации неспаренных оснований ДНК [3].

Для поддержания микросателлитной стабильности в клетке имеется целая группа белков, способных образовывать гетеродимеры между собой. Например, белок MSH2 формирует гетеродимер с белком MSH6 для распознавания и коррекции ошибок в единичных нуклеотидах, исправляет короткие пели, а объединение с белком MSH3 позволяет корректировать более длинные петли. Гетеродимер MLH1 и PMS2 координирует связь между системой распознавания и другими белками системы репарации (MMR) [4, 5]. Накопление таких ошибок в связи с потерей белков MMR называется микросателлитной нестабильностью [6].

Однако снижение эффективности работы над ошибками может быть вызвано не только мутацией гена, кодирующего соответствующий белок, но и эпигенетическим нарушением — гиперметилированием гена MLH1, в результате чего отсутствует синтез белка в клетке [7].

Цель работы — оценить возможность применения иммуногистохимического выявления микросателлитной нестабильности для обнаружения пациентов, чувствительных к ингибиторам контрольных точек иммунитета.

Материал и методы

В исследование включены опухоли 40 пациенток: 31– с тройным негативным и люминальным B, HER2-негативным подтипом. У 18 наблюдаемых пациенток в момент постановки диагноза были метастазы в подмышечные лимфатические узлы. Лечение 16 пациенток было начато с оперативного вмешательства, остальные получали неоадъювантную химиотерапию согласно клиническим рекомендациям по лечению рака молочной железы. Наблюдение за пациентками велось с ноября 2014 г. до сентября 2019 г. За это время 1 пациентка выбыла из исследования, у 2 отмечен рецидив заболевания в виде висцеральных метастазов. Среднее время наблюдения составило 37 мес.

В каждом случае проведено патологоанатомическое исследование операционного материала, определен уровень инфильтрации иммунными клетками (TILs). У прошедших неоадъювантную терапию выполнена оценка остаточной опухолевой нагрузки по системе RCB.

С каждого исследуемого блока изготовлено по 6 срезов толщиной 4 мкм, которые размещались на стеклах с высоко адгезивным покрытием. После ночной сушки в термостате при температуре 37 °C препараты были окрашены в иммуногистохимическом стейнере Ventana Bench Mark Ultra. Первый срез окрашивали реагентом негативного контроля.

Для выявления микросателлитной нестабильности выбраны 3 мышиных моноклональных антитела: Ventana anti-MLH1 (клон M1), Ventana anti-MSH2 (клон G219-1129), Ventana anti-PMS2 (клон A16-4), и одно кроличье Ventana anti-MSH6 (клон SP93). В каждом случае применяли систему детекции OptiVeiw DAB IHC DetectionKit с OptiVeiwAmplificationKit. В качестве контроля использовали аппендикс и фрагмент рака сигмовидной кишки с известным высоким уровнем экспрессии маркеров микросателлитной нестабильности (рис. 1).

Рис. 1. Иммуногистохимические реакции в контрольных препаратах.

а—г: нормальный аппендикс, исследование с антителами к: а — MLH1; б — MSH2; в — MSH6; г — PMS2; д—з: рак ободочной кишки с известным статусом MSS, исследование с антителами к: д — MLH1; е — MSH2; ж — MSH6; з — PMS2. а—г — ×5, д—з — ×10.

При отсутствии экспрессии в 1 препарате из 4 выставлялся статус MSI-L (низкий уровень микросателлитной нестабильности), в 2 — MSI-H (высокий уровень микросателлитной нестабильности. Частичное выпадение экспрессии наблюдалось лишь в некоторых случаях, и согласно методике оценки такие препараты считались позитивными. Если не выпадало окрашивание применяемых маркеров, выставлялся статус MSS (микросателлитная стабильность).

Для оценки PD-L1-статуса опухоли использовали антитело Ventana PD-L1 (клон SP142), систему детекции OptiVeiw DAB IHC Detection Kit с Opti Veiw Amplification Kit. Статус опухоли считали позитивным, когда 1% и более иммунных клеток, расположенных в строме опухоли, имели позитивное окрашивание. Методика проведения анализа и оценки препаратов приведена в нашей публикации [8] ранее.

Статистическую оценку выживаемости проводили методом построения кривых Каплана—Майера, сравнение качественных независимых переменных — при помощи точного критерия Фишера.

Результаты

По данным нашего исследования, 14 (35%) из 40 пациенток имели PD-L1-позитивный статус. При этом выпадение каких-либо маркеров микросателлитной нестабильности наблюдалось в 4 (10%) из 40 случаев. Более того, наличие MSI-H выявлено лишь в 1 (2,5%) случае. Подробные данные приведены в таблице, а примеры позитивного и негативного окрашивания опухолей отражены на рис. 2.

Рис. 2. Иммуногистохимические реакции в опухолях молочной железы.

а—г: позитивные реакции, исследование с антителами к: а — MLH1; б — MSH2; в — MSH6; г — PMS2; д—з: негативные реакции, исследование с антителами к: д — MLH1; е — MSH2; ж — MSH6; з — PMS2; а—з — ×10.

Таблица 1. Характеристики выборки пациентов

Люминальный B, HER2-негативный

С неоадъювантной химиотерапией

Без неоадъювантной химиотерапии

Особый интерес представляла пациентка, у которой опухоль имела высокий уровень микросателлитной нестабильности. На момент обращения у нее были выявлены метастазы в подмышечных лимфатических узлах, позитивный PD-L1-статус и достаточно высокий уровень TILs (40%). Однако в процессе лечения размеры очага значительно сократились, и остаточная опухолевая нагрузка классифицировалась как RCBII.

Двухлетняя выживаемость больных составила 87,5%, при этом следует отметить, что медиана выживаемости не была достигнута ни в исследуемой выборке, ни при разделении на группы по статусам PD-L1 и MSI. Графики выживаемости представлены на рис. 3.

Рис. 3. Кривые общей и безрецидивной выживаемости.

а — безрецидивная выживаемость пациенток с позитивным и негативным статусом PD-L1; б — безрецидивная выживаемость пациенток с наличием или отсутствием микросателлитной нестабильности; в — общая выживаемость пациенток с позитивным и негативным статусом PD-L1; г — общая выживаемость пациенток с наличием или отсутствием микросателлитной нестабильности.

Малая выборка накладывает определенные ограничения и, хотя рейтинг общей выживаемости у пациенток с наличием микросателлитной нестабильности составил всего 75% (3/4), при оценке кривых видно, что продолжительность жизни у них выше. Необходимо также уточнить, что умершая больная обратилась за медицинской помощью на стадии заболевания IIIB в отличие от других пациенток с микросателлитной нестабильностью, размеры первичной опухоли у которых не превышали 21 мм.

Читайте также:  Гиперпаратиреоз - симптомы и лечение

Обсуждение

Методика оценки экспрессии PD-L1 выявила значительно большее количество позитивных случаев, которые потенциально могут отреагировать на иммунотерапевтическое лечение, чем иммуногистохимический метод оценки микросателлитной нестабильности (35,0% против 12,9%). Более того, в группе тройного негативного рака молочной железы частота выявляемости PD-L1-позитивных случаев достигла 38,71%, что приближается к данным, полученным при тестировании на большой выборке [9].

Пока в литературе имеются результаты единичных крупных исследований феномена микросателлитной нестабильности в раке молочной железы. N. Fusco и соавт. [10] на примере 444 опухолей молочной железы продемонстрировали встречаемость этого явления в 16,9% случаев. При этом в тройном негативном раке отмечена самая высокая частота этого события — 20,5%. В нашем исследовании также 3 из 4 опухолей имели тройной негативный подтип, более того, это составило 12,9% выборки тройных негативных карцином. Важно отметить, что N. Fusco и соавт. использовали методику создания тканевых матриц, что вносит погрешность в исследование из-за нередко встречающейся гетерогенности опухоли.

Китайские коллеги проанализировали 151 опухоль молочной железы с различными молекулярно-биологическими подтипами при помощи ДНК-секвенирования. В процессе этого исследования высокая микросателлитная нестабильнось также оказалась крайне редким событием (0,66%), однако дефицит системы репарации ДНК по другим позициям был установлен в 6,62% случаев. В этой работе сравнение с иммуногистохимическим выявлением микросателлитной нестабильности не проводилось [11].

Интересные данные получены этими авторами касательно выживаемости пациенток с высокой микросателлитной нестабильностью: для опухолей с люминальным B подтипом наличие микросателлитной нестабильности оказалось достоверным фактором неблагоприятного прогноза, в то время как для тройных негативных раков наоборот [11]. Удалось выявить несколько случаев с MSI, но все они оказались тройными негативными, при этом выживаемость пациенток была лучше по сравнению с пациентками с MSS. Факт позднего обращения единственной умершей пациентки говорит о невозможности считать микросателлитную нестабильность независимым фактором прогноза.

Существует большое количество статей по оценке статуса PD-L1 как прогностического фактора при раке молочной железы. Например, S. Muenst и Z. Li и соавт. [12, 13] считают, что экспрессия PD-L1 является негативным фактором. В то же время R. Beckers и соавт. [14] пришли к выводу, что мембранное окрашивание PD-L1 не коррелирует с выживаемостью пациенток с тройным негативным раком молочной железы. N. AiErken и A. Kim и соавт. [15, 16] высказывают мнение о лучшей безрецидивной и общей выживаемости таких пациентов. Наше исследование поддерживает позицию последних авторов.

Заключение

В проведенном исследовании обнаружено наличие позитивного PD-L1-статуса опухоли в 35% случаев, а выпадение экспрессии маркеров микросателлитной нестабильности в 10%. Наличие MSI-H отмечено только в PD-L1-позитивном образце.

Первый сравнительный анализ экспрессии PD-L1 и иммуногистохимических маркеров MSI, проведенный на малой выборке, не позволяет сделать однозначных выводов, но показывает необходимость изучения этого феномена на больших выборках и с использованием генетических методов.

Анализ msi при онкологии что это цена

Рак толстой кишки (РТК) является гетерогенной группой злокачественных опухолей, отличающихся молекулярно-генетическими изменениями, течением болезни и прогнозом

За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в лечении рака толстой кишки в том числе метастатических форм.

В отличие от химиотерапии, которая убивает любые клетки, включая здоровые, таргетная терапия действует на раковые клетки специфическим образом, точечно на конкретную мишень. Таргетная терапия обладает гораздо меньшим спектром побочных эффектов в сравнении со стандартной химиотерапией.

Генетическое тестирование позволяет выявить активирующие мутации в ряде онкогенов

Наибольшее значение имеют мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF. Отсутствие мутаций в указанных генах позволяет добавить к лечению анти-EGFR моноклональные антитела

Важнейшие биомаркеры необходимые для
выбора оптимальной тактики лечения

Существование нескольких молекулярно-генетических маркеров определяющих тактику лечения пациентов с РТК свидетельствует о необходимости комплексного генетического тестирования, позволяющего одномоментно диагностировать все необходимые мутации

Пациенты с MSI-H** имеют хороший прогноз и могут отказаться от назначения адьювантной химиотерапии. Пациенты с MSI-H могут отвечать на лечение ингибиторами PD-1

*MSI — микросателлитная нестабильность

**MSI-H — высокий уровень микросателлитной нестабильности

Лаборатория «Геномед» представляет линейку тестов для
рака толстой кишки

40%
пациентов с РТК

6%
пациентов с РТК

15%
пациентов с РТК

Определение мутаций указанных генов является обязательной процедурой при выборе терапии у пациентов с РТК

Тестирование на мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF позволяет отобрать пациентов с диким типом (без мутации) указанных генов, у которых наблюдается максимальная польза при лечении моноклональными антителами, блокирующими EGFR.

Анализ на мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF проводится на ДНК, полученной из ткани опухоли

Наименование Цена
исследования
Срок
выполнения
Определение мутаций в генах BRAF, KRAS и NRAS 11000 руб 14 дней Заказать тест

Анализ на мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF может проводиться на образце плазмы крови!

В процессе разрушения опухолевых клеток высвобождается опухолевая ДНК, которая попадает в кровоток.

Такую ДНК можно детектировать, выделять и исследовать!

В основе метода жидкостной биопсии лежит исследование опухолевой ДНК, циркулирующей в крови пациента. Это неинвазивный метод исследования позволяющий оценить мутаций, возникающие в опухоли, используя образец плазмы крови.

Жидкостная биопсия может применяться:

для пациентов, находящихся в стадии ремиссии с целью ранней диагностики рецидива или прогрессирования заболевания;

для пациентов после резекции опухоли с целью ранней диагностики рецидива или прогрессирования заболевания;

для пациентов, у которых парафиновые блоки были получены несколько лет назад, а для коррекции терапии необходимо понять какие мутации есть в опухоли пациента «сегодня»;

для пациентов, у которых локализация опухоли не позволяет получить ткань для исследования.

Наименование Цена
исследования
Срок
выполнения
Жидкостная биопсия для рака толстой кишки и меланомы 45000 руб 21 день Заказать тест

Микросателлитная нестабильность – это состояние высокой склонности ДНК клетки к развитию мутаций

Такая склонность обусловлена нарушениями в системе репарации ДНК. В норме, организм сам справляется с подавляющим большинством «ошибок» возникающих в структуре ДНК. При раке толстого кишечника, в случае появления мутаций в генах репарации ДНК, возникает накопление ошибок и многочисленных мутаций.

Микросателлитная нестабильность является важным прогностическим и предиктивным маркером при раке толстой кишки

Для чего определяется микросателлитная нестабильность?

MSI – скрининговый тест для диагностики наследственного неполипозного рака толстого кишечника (синдрома Линча).

Высокий уровень MSI у пациентов со I-II стадией РТК свидетельствует о благоприятном прогнозе и о возможности отказа от проведения адъювантной химиотерапии.

Высокий уровень MSI у пациентов с более поздними стадиями требует обязательного применения режимов химиотерапии с включением оксалиплатина.

Опухоли с высоким уровнем MSI чувствительны к иммунотерапии пембролизумабом и ниволумабом.

Расширенная панель увеличивает шансы обнаружения мутаций, имеющих значение при выборе химиотерапевтического лечения

Расширенная панель включает анализ на мутации в генах: KRAS, NRAS, EGFR, PIK3CA, ERBB2, SMAD4, PTEN

Исследование мутаций в рамках расширенной панели доступно как на материале ткани опухоли, так и в плазме крови

Ген Таргетный препарат/
клиническое значение
KRAS Резистентность к панитумумабу и цетуксимабу
NRAS Резистентность к панитумумабу и цетуксимабу
BRAF Резистентность к панитумумабу и цетуксимабу
PIK3CA Трастузумаб
SMAD4 Высокая частота, плохой прогноз
PTEN Высокая частота, резистентность к панитумумабу и цетуксимабу
Наименование Цена
исследования
Срок
выполнения
Расширенное генетическое тестирование для рака
толстого кишечника
Подробнее по телефону:
8-800-333-45-38

Центральный офис МГЦ «Геномед»:

115093, г. Москва, Подольское шоссе,
дом 8, корпус 5 (метро Тульская)

Выберите свой город

Казань
Калининград
Калуга
Кемерово
Киев
Киров
Комсомольск-на-Амуре
Королев
Кострома
Котельники
Краснодар
Краснознаменск
Красноярск
Курган
Курск

Набережные Челны
Нальчик
Нижневартовск
Нижнекамск
Нижний Ломов
Нижний Новгород
Нижний Тагил
Новокузнецк
Новороссийск
Новосибирск
Нур-Султан

Салехард
Самара
Санкт-Петербург
Саранск
Саратов
Севастополь
Симферополь
Смоленск
Сочи
Ставрополь
Старый Оскол
Стерлитамак
Сургут
Сыктывкар

2917 2762 1691 2734 2752 2833 2834 2835 2836 2837 2838 2839 2840 2841 2842 2843 2844 2845 2846 2847 2848 2849 2853 2854 2855 2856 2857 2858 2859 2861 2862 2863 2864 2866 2867 2868 2869 2870 2871 2872 2873 2875 2876 2877 2878 2879 2880 2881 2882 2883 2885 2886 2887 2892 2893 2894 2895 2896 2897 2898 2899 2900 2901 2902 2903 2904 2905 2951 2955 2956 1678 1693 2749 2753 2754 2755 2756 2757 2758 2759 2760 2761 2763 2765 2766 2767 2769 2770 прием только для взрослых;
ул. Б.Бикбая 29А (KDL)
прием для взрослых и детей до 14лет «>2771 2772 2773 2774 2775 2776 2777 2778 2779 2780 2781 2782 2783 2784 2785 2786 2787 2788 2789 2790 2791 2792 2793 2795 2798 2799 2800 2801 2802 2803 2804 2805 2806 2807 2808

Выберите удобный
способ связи

Спасибо,
что выбрали «Геномед»

Сотрудник клиентского сервиса свяжется с Вами в течение 30 минут для подтверждения

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.